1．目的
學(xué)會(huì )CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞。
2．原理
細菌在0℃ CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。
3．器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。
4．試劑
E. coli XL1-Blue，LB培養基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無(wú)菌ddH2O
5．實(shí)驗準備
1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）；平板培養基，LB培養基（滅菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（滅菌），無(wú)菌ddH2O，搖菌試管（滅菌），三角燒瓶（滅菌）。
6．操作步驟
（1）取一支無(wú)菌的搖菌試管，在超凈工作臺中加入2ml LB（不含抗菌素?。┡囵B基。
（2）從超低溫冰柜中取出XL1-Blue菌種，放置在冰上。在超凈工作臺中用燒紅的接種環(huán)插入凍結的菌中，然后接入含2ml LB培養基的試管中，37℃搖床培養過(guò)夜。
（3）取0.5ml上述菌液轉接到含有50ml LB培養基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養2~3h，測定OD600為0.375（<0.4~0.6，細胞數<108/ml，此為關(guān)鍵參數?。?。以下操作除離心外，都在超凈工作臺中進(jìn)行。
（4）將菌液分裝到1.5ml預冷無(wú)菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm離心 10min。
（5）將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。
（6）4℃，5000rpm離心10min，棄上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置30min。
（7）4℃，5000rpm離心10min，棄上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，超凈工作臺中按每管100ml分裝到1.5ml離心管中?？梢灾苯佑米鬓D化實(shí)驗，或立即放入-80℃超低溫冰柜中保藏（可存放數月）。
（8）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。
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