標準品是標記免疫分析定量的依據。標準品的正確與否直接影響樣品的測定結果。如果在連續測定中，或各實(shí)驗室之間使用的標準品不一致，則可影響到實(shí)驗結果的可比性。為此，對標記免疫分析所使用的標準品應滿(mǎn)足如下要求。
一、標準品的要求
1、化學(xué)結構：原則上標準品應與被測物具有完wan全相同的化學(xué)結構，包括相同的立體化學(xué)結構。但在實(shí)際工作中，用化學(xué)結構完wan全相同的物質(zhì)作標準品是十分困難的。這是由于一方面來(lái)源有限，另一方面有些被測物本身的化學(xué)結構還不清楚，或是有明顯的異型性。所以有時(shí)也用結構類(lèi)似的物質(zhì)作標準品。此時(shí)，應充分了解這些物質(zhì)與真正標準品之間的定量關(guān)系。
2、化學(xué)純度：所有通過(guò)化學(xué)合成法制備的小分子化合物，都應是高化學(xué)純度的純品。對某些蛋白類(lèi)物質(zhì)，則可能由于純化的方法不同而有差異。對此，在最初建立該方法時(shí)，應與國ji上公ren認的標準參考品或高純度的純品進(jìn)行比對。
3、免疫純度：標記免疫分析是通過(guò)比較被測物質(zhì)與標準品的免疫活性實(shí)現的，故被測物質(zhì)與標準品對所用抗體的免疫活性應該wan全一致，即兩者對所用的同一抗體有wan全相同的親和力。因此，標準品的免疫純度比其化學(xué)純度更重要。
4、反應介質(zhì)：免疫學(xué)反應受反應介質(zhì)和溫度等條件的影響，所以理論上要求標準品和被測物應在wan全相同的介質(zhì)中進(jìn)行反應。如測定血清中某物質(zhì)的濃度，其所用的標準品也應溶解在無(wú)被測物的零值血清中；如測定尿液中某物質(zhì)的濃度，其所用的標準品也應溶解在無(wú)被測物的尿液中等。但在實(shí)際工作中這一點(diǎn)很難做到。因為，血清中的成分十分復雜，因而無(wú)被測物的零值血清的制備非常困難，而且個(gè)體血清中還可能存在一些干擾物質(zhì)。理想的標準品應該用與被測樣品相同的基質(zhì)(如血清)，先將被測物質(zhì)wan全去除，然后再加入已知量的被測物質(zhì)的純品。
5、干擾物質(zhì)：標準品中不能有干擾分析的物質(zhì)。在作為標準品使用前，必須對那些從機體提取到的大分子物質(zhì)活性進(jìn)行測定。
6、標準品的批量：為保證檢測的連續可比性，每批標準品應有相當大的量，以保證在較長(cháng)的時(shí)間內使用。每批標準品如保存的條件適當，在相當長(cháng)的時(shí)間內可保持其濃度和免疫活性的穩定。這對于生產(chǎn)標記免疫分析試劑的廠(chǎng)家尤為重要。
二、標準品的分級
所謂標準品在英語(yǔ)中有三個(gè)名詞，即標準品 (standard)、校準品(calibrator)和參考品(reference)。這三個(gè)名詞的意義不wan全相同，但在國內它們則經(jīng)常被混淆。目前在我國的標記免疫分析實(shí)踐中，所謂的"標準品"實(shí)際上是指校準品。為使用方便先仍用"標準品一詞"。
有關(guān)標準品可分為如下的等級：
【國際參考品(international reference)】：國際參考品是由WHO指zhi定的實(shí)驗室制備，并與有關(guān)國家的一定機構聯(lián)系(在我國是衛生部藥品與生物制品檢定所)，被國ji公ren認為最高ji別的標準品。到目前為止，與標記免疫分析有關(guān)的已達數十種。但由于標記免疫分析方法的迅速發(fā)展，很多標記免疫分析方法還沒(méi)有國際參考品。
【國家ji標準品】：國家ji標準品是由國家的有關(guān)權wei威機構，用高化學(xué)純和高免疫純、低交叉反應的純品制備的，供國家內部使用。國家ji標準品應與國際參考品或其他國家的國家ji標準品進(jìn)行比對。我國現已有國家ji標準品數種，如胰島素(insulin)、絨毛膜促性腺素(hCG)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、肝膽酸(CG)、甲胎蛋白(AFP) 等。
【實(shí)驗室標準】：實(shí)驗室標準是由實(shí)驗室自己，或由生產(chǎn)廠(chǎng)家制備的標準品，又稱(chēng)二級標準品。所有的二級標準品都必須經(jīng)過(guò)與國家標準品或國際參考品進(jìn)行比對或校正。如沒(méi)有國際參考品或國家ji標準品的，也應與國ji公ren認的生產(chǎn)廠(chǎng)家的標準品進(jìn)行比對。
三、標準品的制備、鑒定、與計量
1、標準品的制備：標準品的制備是非常復雜的問(wèn)題，也是標記免疫分析中比較難于制備的一個(gè)成分。以下討論的是實(shí)驗室標準品(或商品化試劑中標準品)的制備。
?。?）基質(zhì)的制備：如前所述，作為標準品的介質(zhì)(基質(zhì))成分應與被測樣品相同。對大多數用于測定血清中某物質(zhì)的標準品，應用不含被測物質(zhì)的零血清制備，以求反應的介質(zhì)環(huán)境相當。但有時(shí)零值血清的制備十分困難，所以有些標準品用適當的緩沖液制備，并在緩沖液中加入一定量的載體蛋白(一般用1%～2%的牛血清白蛋白)，以便使其與樣品的介質(zhì)環(huán)境相近。
零值血清的制備方法有：
A、吸附法：血清中小分子物質(zhì)如三碘甲狀腺原氨酸 (T3)、甲狀腺素(T4)等，可用活性炭吸附去除。這種方法簡(jiǎn)便，但待測物質(zhì)難以清除干凈，而且大分子活性物質(zhì)不能用此法進(jìn)行制備。
B、反復凍融法：對大分子活性物質(zhì)可選用低值血清，經(jīng)反復凍融使被測物質(zhì)失活。用這種方法可使某些蛋白類(lèi)激素大部分失活，但也難以得到真正的零值血清。
C、親和層析法：用特異性抗體制備親和層析柱，用以吸附被測抗原。用這種方法可以得到高質(zhì)量的零值血清，但本法比較復雜而且成本也高。
?。?）標準物純品的選擇：應選擇高化學(xué)純和高免疫純的純品作標準品。其中免疫純尤為重要，在標準品中不應含有與被測物質(zhì)有交叉反應的物質(zhì)。
?。?）標準品的制備：先用零值血清配置高濃度的標準品，然后根據實(shí)驗系統的要求，用零值血清將高值血清稀釋至應有的濃度，制成符合預定要求的，由不同濃度組成的系列標準品。
2、標準品的鑒定
?。?）免疫活性的鑒定：選用高特異性的抗血清分別作公ren認標準品(如WHO的國際參考品或國家標準品)的待鑒定標準品的劑量反應曲線(xiàn)，并觀(guān)察兩條曲線(xiàn)的平行性。如兩條劑量反應曲線(xiàn)平行，說(shuō)明兩種物質(zhì)對同一抗體有相同的親和力，即二者是同質(zhì)性物質(zhì)。如兩條劑量反應曲線(xiàn)不平行，說(shuō)明兩種物質(zhì)具有異質(zhì)性，因而這一待鑒定的標準品是不能使用的。
?。?）濃度的標定：用已鑒定過(guò)的，免疫活性合格的標準品，與公ren的標準品作濃度相同的劑量反應曲線(xiàn)。此時(shí)，兩條劑量反應曲線(xiàn)應該是基本重合的。如果兩者平行但不重合，則取兩條劑量反應曲線(xiàn)的50%結合處的相應劑量( ED50 )計算二者的換算系數，然后調整待鑒定標準品的濃度，直至使兩條劑量反應曲線(xiàn)wan全或基本重合為止。
3、標準品的計量：許多小分子抗原或半抗原已能得到純品或進(jìn)行合成，它們對作為標準品的要求可以得到基本的滿(mǎn)足，其計量多直接用單位體積中的重量表示，如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推薦用質(zhì)量單位取代重量單位，即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。對大分子的活性物質(zhì)則比較復雜。由于得不到絕對的純品，故很難直接用單位體積中的重量或單位體積中的質(zhì)量計量。因此，常用該物質(zhì)的生物活性單位表示，如IU / L、mIU / L等。
四、標準品的穩定性與保存
如前所述，為保證檢測的連續可比性，每批標準品應有相當大的量，以保證能在較長(cháng)時(shí)間內使用。因此，每批標準品應在適當的條件下保存，使其免疫活性和濃度保持穩定。
1、影響標準品穩定的因素
?。?）基質(zhì)中的酶、細菌污染、pH的變化、氧化、潮濕等因素都可以導致標準品的變性，而且這些變化可因高溫和光照加速。
?。?）在保存過(guò)程中發(fā)生聚合反應等分子結構的變化，可使標準品失活。
?。?）容器內壁的吸附作用和溶劑的蒸發(fā)可造成標準品濃度的改變。
?。?）保存條件不適當也可以影響標準品的穩定性，如反復的凍融可降低標準品的免疫活性等。
2、標準品的保存方法
?。?）冷凍干燥法：冷凍干燥對標準品的濃度和免疫活性無(wú)明顯的影響，是目前最chang用的保存方法。冷凍干燥制品在低溫下，可在較長(cháng)的時(shí)間內保持穩定。但應用冷凍干燥制品時(shí)，復溶體積的準確度十分重要。因此，要用經(jīng)過(guò)校準的量器準確的復溶，以減少標準品的濃度誤差。
?。?）在標準品中加一定量的防腐劑可減少細菌污染的影響。
?。?）密閉真空保存或充入惰性氣體等方法也可以增加標準品的穩定性。 目前最chang用的方法是：在標準品中加入少量的防腐劑(如0.1%疊氮鈉或0.1%硫柳汞)，冷凍干燥后密封，并在低溫下保存。但應注意，一旦復溶后應放低溫保存，并不得反復凍溶。復溶后的標準品其有效期明顯縮短，一般不超過(guò)6～8周，有些物質(zhì)可能更短。
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